WB結果不理想可能的原因自查

從結果倒推操作過程中可能的問題，總的來說，WB結果不理想，可能的問題主要集中在以下幾方面部分：

1、陰性結果的原因

1) 二抗條件過低：提高二抗濃度、延長二抗孵育時間或孵育溫度
2) 一抗條件過低：提高一抗濃度、延長一抗孵育時間或孵育溫度
3) 抗原過少：提高上樣量
4) 抗體種屬不兼容：需要檢測樣品的種屬來源，一抗與二抗是否相匹配
5) 酶活性：二抗上標記的HRP或AP等酶活性降低，如抗體過期或反復化凍等
6) 封閉過度或封閉劑不兼容：降低封閉劑濃度、縮短封閉時間，或者更換封閉劑種類
7) 底物出現質量問題：可以通過點雜交試驗排除底物和酶活性問題
8) 抗體稀釋液pH：注意檢測pH是否在6-8
9）樣品不表達該目的蛋白
10）轉膜不足或過頭：優化轉膜條件
11）其它：PVDF膜、保鮮膜質量問題等
12）抗體質量：建議使用好品牌的抗體。

2、有雜帶或背景的原因

1）目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小

2) 樣本處理過程中目的蛋白發生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作

3）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質變性過程及強度

4）上樣量過高：降低上樣量，減少抗原含量

5）二抗條件過強：降低二抗濃度、縮短二抗孵育時間或改變溫度等
6）一抗條件過強：降低一抗濃度、縮短一抗孵育時間和改變溫度等
7）抗體質量不佳：如特異性不好，建議購買品牌公司的抗體

8）一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度

9）一抗孵育的溫度偏高，建議4℃結合過夜

10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數和時間

11）膜清洗不全：增加清洗強度，如增加蕩洗次數、延長清洗時間等
11）ECL發光液本身因外源污染等原因存在很強的背景光，顯影可以顯示強的背景光，建議分裝A和B液或更換發光液
12）縮短壓片或曝光時間

14）電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調整電極和加樣

15）封閉不全：二抗與抗原有交叉反應，升高封閉劑濃度、延長封閉時間或更換不同的封閉劑，孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜

16）封閉物使用不當，比如檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉；

17）封閉時間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時以上或者4度封閉過夜

18）抗體非特異性結合，可以降低抗體濃度，減少孵育時間

19）化學顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物

3、啥條帶形狀不好看

1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻

2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或將樣品鹽濃度調成一致

3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配

4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走

5）電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓

6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻

4、蛋白條帶位置（大小）不對

1）膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調整濃度

2）抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時間

3）酶失活，建議直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物

4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關文獻確定

5）標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設置陽性對照比對結果，增加標本上樣量

5、背景有黑色斑點或不均勻的白色斑點和暗背景上白色帶

1）抗體與封閉試劑反應，建議使用前過濾封閉試劑

2）HRP含量過高，建議降低酶聯二抗的濃度

3）HRP偶聯二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體

4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時使用搖床

6、細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白

1）細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞

2）抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題

3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長

4）細胞中的蛋白質被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性

7、目的帶很弱，如何加強

1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的

2）也可以將一抗稀釋比例降低

3）還可以延長曝光時間