穩(wěn)轉細胞系構建中常見問題：

1. 是否需要進行密碼子優(yōu)化？

由于氨基酸密碼子的簡并性和tRNA的種類多樣性、數(shù)量的差異，密碼子優(yōu)化對長基因穩(wěn)轉細胞系的構建有很強的必要性，可以大幅提高目標蛋白的表達量。

2. Kozak序列是必須要添加的嗎？

Kozak序列（通常是GCCACCatgG），真核生物mRNA真正的起始密碼子位于Kozak序列的保守序列中，其共有序列是CCRCCAUGG，幾乎所有mRNA的翻譯起始都依賴于5’帽子結構募集小亞基，少數(shù)通過內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)募集小亞基。Kozak序列通過與翻譯起始因子eIF形成翻譯起始復合物，起始蛋白的翻譯。

3. 啟動子的選擇

CMV（巨細胞病毒）啟動子除了在干細胞外，其他大多數(shù)細胞類型中均可以獲得高表達活性。懸浮細胞中SFFV啟動子表達活性相對較高。而EF1a（延伸因子-1α）啟動子更適用于表達長片段的基因。CMV；EF1A；CAG；CBh；SFFV，等均屬于強啟動子，都可作為穩(wěn)轉細胞系構建可選啟動子。

4. 穩(wěn)轉細胞系培養(yǎng)體系

穩(wěn)轉細胞系一般建議用半抗性篩選濃度維持細胞生長，如hepG2細胞puro抗性篩選濃度為2μg/ml，則建議用1ug/mL+完全培養(yǎng)基維持生長；部分基因過表達后會影響細胞代謝，尤其腫瘤細胞，糖酵解代謝速率受影響，細胞生長緩慢，可相應添加葡萄糖或者HEPES調(diào)節(jié)細胞細胞代謝水平，維持細胞增殖。

5. 標簽放在N端還是C端好？

如果N端有信號肽，建議放在C端；蛋白如果較小，建議放在C端，減少蛋白降解；如果下游有P2A，T2A等自剪切肽，建議放在C端。如果為了添加Kozak序列，建議加在N端。如果純化中需要酶切標簽，建議放在N端。

6. 是否可以構建穩(wěn)轉敲除的細胞系？

一般不建議，因為敲除元件穩(wěn)定持續(xù)的表達在細胞中，累積脫靶效應明顯，影響細胞狀態(tài)。